6 第六章 毒理学试验设计

第六章 毒理学试验设计(补充)

二、品系选择

相同基因类型一近交系
是采用兄妹交配（BXS——brother sister)或亲子交配（PXO——parent offspring,父母
与子女交配）,连续繁殖20代以上而培育出来的纯品系动物。一般以小鼠为典型代表。
优点：基因纯正
缺点：价格昂贵，抵抗力差

杂交群动物（Hybrid animals)
也称杂交一代动物或系统杂交动物。是指两个近交品系动物之间进行有计划交配所获得的第一代动物。简称F1动物。一般只用子一代F1,有时也用子二代F2.
最理想的品系：基因纯正，杂交优势

封闭群动物（Closed colony animals)
是指一个动物种群在五年以上不从外部引进其他任何品种的新血缘，由同一血缘品种的动物进行随意交配，在固定场所保持繁殖的动物群。一般对群的大小、封闭年月、繁殖结构等均有明确的规定。
毒理最常用的品系：基因较纯，抵抗力强，经济，易获得。

总原则：

1. 尽量选择毒性反应与人近似的动物；
2. 易于饲养管理、试验操作方便的动物；
3. 繁殖生育能力较强，数量较大能够保障供应；
4. 价格较低，易与获得的动物。

四、个体选择

1. 实验动物的性别、年龄、体重和数量。
2. 要求刚成年、健康未曾交配和受孕的动物。
3. 同一次试验同一批实验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20%。
4. 性别通常要求雌雄各半，但要视具体实验要求而定动物。
5. 分组应严格遵循随机化原则。

五、实验动物管理
六、模式生物简介

三 受试物处理及染毒途径
试验前应对受试物的化学结构、纯度、杂质成分、理化性质特别是挥发性、溶解性等进行全面了解。

数据来源：
(1)生产厂家
(2)检索与受试物化学结构和理化性质相似的化学物的毒性资料

受试物的成分、配方应稳定不变：
一般为新鲜配置（除非是很稳定的）:
水溶性：蒸馏水或去离子水
注射用：生理盐水
脂溶性：色拉油、玉米油、0.5%羚甲基纤维素钠

染毒途径的选择原则：

• 模拟人在生活和生产环境中实际接触该受试物的途径和方式；
• 有利于不同化学物急性毒性大小的比较；
• 受试物的性质和用途；
• 各种受试物毒性评价程序的要求等。

工业化学物：经皮肤和呼吸道
农用化学物：经口、经皮肤和呼吸道
药品：经口和注射
食品：经口
环境污染物：经口、皮肤和呼吸道

吸收速率*:
静脉注射>吸入>肌内注射>腹腔注射>
皮下注射>经口>皮内注射>经皮

1. 经口（胃肠道）染毒
新化学物毒性评价的必经之路，一般以经口途径的LD50值来比较不同化学物急性毒性大小。
分为灌胃、喂饲、吞咽胶囊等方式。

• 经口灌胃染毒：
  是实际工作中急性毒性试验中最主要、最常用的染毒途径。
  优点：剂量准确；
  缺点：工作量大，有误入气管和损害食管的可能。
• 喂饲：
  将受试物掺入动物饲料或水中供实验动物自行摄入。
  优点：符合人类接触许多化学物的实际情况，染毒方便；
  缺点：剂量误差大、适口性差(老鼠不喜欢吃，闻得出来)、影响动物摄食和生长发育
• 吞咽胶囊
  将一定量的受试物装入胶囊中，放至舌后部，迫使其咽下。
  适用于有异味、易挥发、易水解的物质。
  多用于犬、猴的给药

2. 经呼吸道染毒
常用于研究生产条件下以气体、蒸汽、粉尘、烟、雾等形式存在的工业毒物，环境空气污染物，以吸入为给药途径的药物。rhe染毒方式分为吸入染毒和气管内注入；
吸入又分为静式和动式吸入染毒。

A.静式吸入染毒
优点：设备简单、操作方便、受试物消耗量少。
缺点：氧分压下降，柜内受试物浓度逐渐下降，可能经皮吸收；不适合较大动物和挥发性不强的受试物。
100L染毒柜可供大鼠1~2只，小鼠12~15只，呼吸2小时
B.动式吸入染毒
由染毒柜、机械通风、配气系统三大部分组成

1. 动式吸入染毒：
   将动物整体置于染毒柜中
2. 面罩吸入染毒：
   仅将动物的口鼻部分与含有受试物的空气接触
   优点：
   实验过程中受试物浓度和氧分压较稳定；
   缺点：
   对设备要求高，受试物消耗量大，操作比较复杂，费时费工。较少采用此法。
3. 经皮肤染毒
   常用于评价农药、化妆品、外用药物、工业毒物、环境污染物等。
   理论上应采用小型猪、家兔或豚鼠，但出于经济原因，一般使用大鼠。
4. 经注射途径染毒
   常用于药品、化学毒物机制和毒物代谢研究的急性毒性试验。
   可分为：
   静脉注射（iv)或滴注
   腹腔注射（ip)
   肌内注射（im)
   皮下注射（H)
   皮内注射（id)
   椎管内注射等。

剂量选择
---试验的关键
剂量设计注意事项：
1.了解受试物的化学结构式，理化特征、生产批号、纯度、杂质成分等。
2.根据受试物特点、研究目的和法规要求确定试验方法和剂量分组

实验设计过程应遵循基本原则

一 统计原则

• 随机：代表性
• 对照：空白/阴/阳性对照，自身对照，历史性对照
• 重复：样本量、重复次数

二 动物选择原则

• 首先考虑代谢与毒性效应上与人一致
• 注重对受试物毒性敏感的动物物种
• 种属、品系、个体差异
• 自然寿命不太长、易于饲养和实验操作、经济易获得
• 动物年龄、性别
  没有一种实验动物完全符合物种选择的原则
  目前常规选择2个物种：咽齿类+非喘齿类

三 剂量分组原则
实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在危害的必需和可靠的办法。
除对照组外，一般设3个或3个以上剂量组，以观察剂量-反应（效应）关系，确定受试化学物引起的毒效应及其毒性参数。

高剂量组：
应出现明确的有害作用，或高剂量组已达到极限剂量或染毒的最大剂量

中剂量组：
介于高低剂量组之间，应出现较轻的毒性效应（相当于LOAEL)

低剂量组：
应不出现任何可观察到的有害作用(即相当于NOAEL),但应当高于人可能的接触剂量，至少等于人可能的接触剂量三组剂量一般按等比例计算，低剂量组一般为高剂量组的1/10-1/20

四 试验期限
一般由毒性实验的定义决定：
急性毒性：一次或1d内多次观察14d
亚慢性毒性：持续至实验动物寿命的10%(大/小鼠90d,狗1年）
某些试验（如致畸和多代生殖试验）由受试实验动物物种或品系决定。

五 给受试物途径
尽可能利用人拟用途径
吸收速率：
静脉注射>吸入>肌内注射>腹腔注射>皮下注射>经口>皮内注射>经皮

质量控制
优良实验室规范（good laboratory practice,GLP)
安全性评价的最终产品并没有实体，而是数据。

毒理学实验结果评价
统计学意义
生物学意义
毒理学意义

统计分析

• 是否具有统计学意义
• 是否具有生物学意义，即是否是真实的效应
• 是否具有毒理学意义，即是否是有害效应
  

毒理学实验结果评价
在判断生物学意义时应先考虑：

• 剂量依赖性趋势
• 结果的重现性
• 相关指标结果的一致性
• 差别的大小和类型
• 两种性别的一致性

转基因动物模型的应用
概念：
转基因动物（transgenic animal),指用方法将外源基因(人工分离或修饰过的基因）导入或整合到其基因组内，并能将外源基因稳定遗传给下一代的一类动物。

• 转入的目的基因称为转基因（transgene),这种转移目的基因的过程称为转基因作用（transgenesis)。

(一）转基因动物的培育原理与技术方法

1. 转基因动物的培育原理
   利用分子生物学和胚胎工程技术，将外源目的基因在体内新增和加工并导入动物的生殖细胞或早期胚胎细胞中，使其整合到染色体上（非靶向整合和靶向整合）。

2. 转基因动物的制备方法
   (1)显微注射法
   (2)反转录病毒介导基因转染（retrovirus-mediated gene transfer)
   (3)胚胎干细胞基因转染（enbryonic stem cells gene transfer)
   (4)精子介导的基因转染：精子载体法（sperm mediated genetransfer)
   (5)锌指核酸酶（ZFN)技术
   (6)TALEN基因编辑技术
   (7)CRISPR基因编辑技术

(1)显微注射法
显微注射法是通过显微操作仪将外源基因直接注射到受精卵的原核中，该法是产生最早且又最为有效的转基因方法。
但原核显微注射法技术难度比较大，不仅需要昂贵的仪器，而且需要一定的操作技巧。

优点：
外源DNA大小
基本不受限制（1-50kb
导入过程直观
整合率高

缺点：
设备昂贵、环节较多
对操作人员有较高的技术要求
低效率（尤其是大家畜）
对卵子伤害大，胚胎存活率低
基因整合随机性
转基因沉默

(2)逆转录病毒感染胚胎法
将外源基因重组到DNA病毒或RNA病毒上，再用重组的DNA病毒或RNA病毒去感染着床前后的胚胎，随后病毒基因插入到宿主胚胎基因组中，外源基因也自然整合到胚胎基因组中。

优点：
受精卵携带外源基因的阳性率高
外源基因多单拷贝整合
操作简单，避免注射法对卵子的损害
宿主范围广
可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高。

等等等等